فناوری نانو و تشخیص بیماری‌های گیاهی

پراکنش بیماری‌های گیاهی در سطح جهانی افزایش‌یافته، این در حالی است که هزینه‌های اختصاصی برای تشخیص و کنترل پاتوژن‌ها (عوامل ایجادکننده بیماری)، با محدودیت مواجه است (حدود 3% از کل هزینه تولید) [1]. به‌طورکلی برآورد شده است که در دنیا آفات، بیماری‌ها و علف‌های هرز باعث از بین رفتن به ترتیب 14، 13 و 13 درصد محصولات کشاورزی می‌شوند. پاتوژن‏‎ها به دلیل ایجاد شرایط تنش شدید برای گیاهان باعث کاهش چشمگیر در بهره‌وری می‌شوند درحالی‌که روش‌های تشخیص دقیق آن‌ها هزینه‌های زیادی را به دولت‌ها و تولیدکننده‌ها تحمیل می‌کند [1]. تاکنون تلاش‌های زیادی برای تولید ایمن‌تر محصولات کشاورزی تحت شرایط محیطی متفاوت، به‌وسیله دستگاه‌های حفاظت کننده و مدیریت بهتر انجام‌گرفته است. به هر ترتیب، حفاظت از محصولات، کلید دستیابی به تولید پایدار به‌خصوص در شرایط نامطلوب زیست‌محیطی است.
روش‌های تشخیصی مولکولی سنتی به‌طور گسترده‌ای در آزمایشگاه‌های سراسر جهان برای شناسایی عوامل بیماری‌زای گیاهی، با درجه بالایی از حساسیت و عملکردی اختصاصی، در حال استفاده است. بااین‌حال بسیاری از این روش‌ها را نمی‌توان در مزرعه (تشخیص در محل) و یا در کشورهای درحال‌توسعه که درآمدها کمتر است، مورداستفاده قرارداد. علاوه بر این، قیمت بالا و نیمه‌عمر کوتاه برخی از مواد بیولوژی مولکولی، مانند آنزیم‌ها و آغازگرها (توالی‌های کوتاه از مولکول DNA که در آزمون‌های تشخیصی مورداستفاده قرار می‌گیرند ) دلیل استفاده از آزمون‌های ژنتیکی-مولکولی، حضور تمام یا جزئی از ساختار ژنتیکی عامل بیماری در بافت میزبان گیاهی است) در شرایط محیطی عادی، عاملی محدودکننده در استفاده از روش‌های سنتی مولکولی در کشورهای درحال‌توسعه است. فناوری نانو می‌تواند راه‌حل‌هایی واقعی در برابر بسیاری از مشکلات کشاورزی مانند کنترل بیماری‌های گیاهی ارائه کند [2]. ترکیبات مبتنی بر نانوفناوری که ارائه خواهد شد می‌توانند اثر ضد قارچ‌ها و آفت‌کش‌ها را افزایش دهند. در نتیجه، دوز کمتری از آن‌ها در محیط و طبیعت استفاده خواهد شد. به‌علاوه روش‏های تشخیصی بر پایه نانو با ارائه ابزارهای جدید مرحله آماده‌سازی نمونه را که بخشی دشوار و مهم در فرآیندهای مربوطه به‌حساب می‌آید، بهبود بخشیده و موفق به‌جای دادن آن‌ها در پلتفرم‌های کوچکی شده است. "تشخیص در محل" سریع پاتوژن‌های گیاهی با استفاده از کیت‌های بر پایه نانو نظیر نانو حسگرها، نانو حسگرهای زیستی، نانو بارکدها و دیگر سامانه‌های تشخیصی قابل‌حمل، به کشاورزی و صنایع وابسته جهت مدیریت بیماری‌های گیاهی کمک خواهند کرد.
1-1- تشخیص آفات و بیماری‌های گیاهی به‌وسیله نانو و نانو گیاه‌شناسی
گسترش یا ادغام تشخیص‌های مولکولی در مقیاس نانو، فناوری امیدبخشی در شناسایی عوامل بیماری‌زا است. تشخیص‌های مولکولی بر پایه فناوری نانو در شناسایی بیماری‌های گیاهی در قالب اصطلاح "نانو تشخیصی"(Nano-diagnostic) معرفی می‌گردد [1]. درحال حاضر ترکیباتی که در ابعاد نانو تهیه و توسعه‌یافته‌اند به‌عنوان موفقیتی خارق‌العاده در تشخیص پاتوژن‌ها و آلاینده‌ها به‌حساب می‌آیند.
نانو گیاه‌شناسی ازجمله علومی است که به‌عنوان لبه مرزهای دانش شناخته می‌شود و فناوری نانو را در تشخیص، شناسایی و کنترل بیماری‌های گیاهی و پاتوژن‌ها در مراحل اولیه و قبل از گسترش و اپیدمی شدن، بکار می‌گیرد. روش‌های نانو مولکولی مدرن در رصد و درک جمعیت ژنتیکی پاتوژن‌ها، تداخلات گیاهان و میکروب‌ها و انتقال ژن بین پاتوژن و میزبان مورداستفاده قرار می‌گیرند. علاوه بر این نانو ذراتی مثل سیلیکا-نقره اخیراً به‌عنوان عوامل ضد میکروبی و قارچی بکار گرفته می‌شوند. همچنین نانو موادی می‌توانند برای تشخیص مایکوتوکسین (سمومی که توسط قارچ‌ها تولید می‌شوند.) و سم‌زدایی استفاده شود.

2- فناوری‌های تشخیص پاتوژن‌های گیاهی
2-1- دستگاه واکنش زنجیره پلیمراز قابل‌حمل
قابلیت تولید امپلیکون (Ampliqon)(محصول واکنش زنجیره پلیمراز یا همان PCR) با سرعت بالا و توسط دستگاهی که قابل حمل باشد به متخصصین بیماری شناسی امکان اظهارنظر دقیق‌تری را می‌دهد. همچنین توانایی آن‌ها را نیز در پیش‌بینی وجود عامل بیماری‌زا افزایش خواهد داد. استفاده از این ابزار به‌طور قابل‌توجهی فرآیندهای پایین‌دستی را نیز ساده‌تر خواهد کرد که ازجمله این فعالیت‌ها می‌توان به کاربرد ابزارهای تشخیص ژنومی در محل اشاره کرد.
2-2- توالی یاب ژنومی قابل‌حمل (سیستم توالی یابی نانو حفره‌ای)
بسیاری از شرکت‌ها در حال تحقیق بر روی نظریه استفاده از فناوری نانوحفره (Nanopore) هستند. در این سیستم توالی‌یابی، دو چالش اصلی وجود دارد که باید به آن‌ها توجه و پرداخته شود [1[
1- چگونگی تشخیص نوکلئوتیدها (اجزای تشکیل دهنده ساختار DNA (توسط حفره‌ها و بالعکس برای عبور دادن رشته DNA از این منافذ
2- چگونگی کنترل سرعت DNA در حین عبور از نانو حفره‌ها
باوجود چنین چالش‌هایی، پلتفرم‌های توالی یابی نانوحفره‌ای بسیار کاربردی و ارزشمند خواهند بود. زیرا، خوانش‌های (رشته‌های DNA به‌صورت توالی‌های کوتاه و بلندی از چهار نوع مولکول با خاصیت بازی به نام‌های آدنین، تایمین، سایتوزین و گوانین وجود دارند، که به هر فاز تشخیص ترتیب قرارگیری این بازها در رشته DNA، "خوانش" و به کل فرآیند "توالی‌یابی" گویند.) بسیار طولانی را با استفاده از غلظت‌های بسیار ناچیز DNA می‌توانند ارائه دهند [4]. در این حفره‌ها پروتئین‌ها و آنزیم‌هایی به‌صورت سنتزی و مهندسی‌شده قرارگرفته‌اند تا حتی‌المقدور چالش‌های ذکرشده را حل کنند و همچنین با عبور هر رشته اسیدنوکلوئیک از خود، به ازای هر باز عبوری پالس الکتریکی متفاوتی را تولید کنند. طراحی این سیستم به این صورت است که نانو حفره‌های پروتئینی در غشایی پلیمری و دولایه قرارگرفته‌اند که در قسمت تحتانی آن‌ها میکروگودال‌هایی تعبیه شده، هر میکروگودال مجهز به حسگری است که جریان الکتریکی حاصل را به ازای هر نوکلئوتید اندازه‌گیری می‌کند . این سیستم بسیار سریع و دقیق است. بیش از 1000 آزمایشگاه در حال آزمودن دستگاه تجاری شده و انتشار نتایج آن می‌باشند. پژوهشگران، تجارب خود را در مورداستفاده از این دستگاه در مصاحبه با Nature Methods بیان می‌کنند. بعضی از پلتفرم‌هایی که بر پایه این سیستم طراحی‌شده‌اند می‌توانند درزمانی حدود 15 دقیقه‌ای کل ژنوم موجود را توالی یابی کنند [1]. البته ذکر این نکته هم حائز اهمیت است که شرکت‌های دیگری نیز درحال‌توسعه تکنولوژی‌های توالی یابی بسیار پرسرعت و ارزان‌قیمتی هستند که ازجمله آن‌ها می‌توان به شرکت‌های Roche و IBM اشاره کرد. تکنولوژی‌هایی ازاین‌دست در رابطه با توالی یابی DNA را سامانه‌های توالی یابی نسل بعد یا به‌اختصار NGS (Next Generation Sequencing) می‌گویند. پلتفرم نانو حفره در ترکیب با دانش و تجهیزات تشخیصی در بیماری شناسی گیاهی می‌تواند زمان تشخیص را از چندین ساعت و یا حتی روز به چندین دقیقه تقلیل داده و دقت را در حد بسیار بالایی افزایش دهد.
2-3- کیت‏های نانو تشخیصی
بیماری شناسان گیاهی، برنامه‏ دارند این کیت که "آزمایشگاه در یک جعبه(lab in a box) "  نام دارد را به‌زودی موردمطالعه قرار دهند. این نام اشاره به یک بسته شامل ابزارهای اندازه‏گیری پیشرفته، معرف‌ها، منبع تغذیه و ترکیبات دیگر دارد که در حال حاضر فضای آزمایشگاهی را به بسته‏ای کوچک‌تر و سبک‏تر از یک چمدان رسانده است. کیتی با اندازه‏های یک چمدان، به مزرعه‏ای که در آن محصولات زراعی در حال کشت هستند منتقل‌شده و به‌منظور جستجوی عوامل بیماری‌زا که می‏توانند باعث آلودگی و کاهش عملکرد شوند مورداستفاده قرار می‏گیرد که روشی سریع و دقیق است. کیت‏های نانو تشخیصی (Nanodiagnostic) می‌توانند به‌راحتی و به‌سرعت عوامل بیماری‌زای جدی و بالقوه گیاهی را شناسایی کرده و این امکان را برای کارشناسان فراهم آورند تا در پیشگیری از شیوع بیماری‏ها به کشاورزان کمک کنند [1[
2-4- نانو ذرات و زیست حسگرها
استفاده از نانو مواد یا نانو ذرات در زیست حسگرها، امکان توسعه و استفاده از برخی روش‏ها و ابزارهای جدید تشخیص سیگنال را فراهم می‏کند. استراتژی‏های مختلفی مانند آنتی‏ژن-آنتی‌بادی، الحاق به گیرنده (Adhesion receptor)، آنتی‏بیوتیک و روش‏های شناسایی توالی DNA مکمل برای تشخیص اختصاصی سلول‏های بیماری‌زای گیاهی از نانو مواد عامل‏دارشده زیستی، ابداع شده است [5[
2-5- نقاط کوانتومی (QDs)
نقاط کوانتومی (QDs) نانو ذرات نیمه‌رسانایی هستند که وقتی با یک منبع نوری برانگیزاننده تحریک می‏شوند، از خود خاصیت فلورسنس نشان می‏دهند. علاوه بر این، نقاط کوانتومی، فلوروفورهایی معدنی هستند که مزایای عمده‏ای بر فلوروفورهای (Fluorophores) آلی سنتی دارند. فلوئوروفورهای آلی سنتی به‌عنوان نشانگر در اسیدهای نوکلئیک یا پروتئین برای تشخیص بصری استفاده می‌شوند. مایکوسنتز (بیوسنتز در قارچ‌ها) نانومواد نیمه‏هادی برای اولین بار در مخمر تک‌سلولی گزارش شد، که در آن نشان داده شد این موجود قادر به تولید بلوره‌های سولفید کادمیوم (CdS) در پاسخ به تنش شوری کادمیوم می‌‏باشد. میکروب‏‌های مختلفی نیز برای بیوسنتز CdS مورداستفاده قرارگرفته‌اند؛ بااین‌حال، مطالعات کمی بر روی خواص لومینسانس (Luminescent) آن متمرکز شده است [1[

2-6- نانو بارکدها
مولکول DNA زیست بارکددار شده (b-DNA) (bio-barcoded DNA )
روش‌های رایج تشخیصی DNA، بر پایه PCR و استفاده از مولکول‌های فلوروفور معدنی به‌عنوان نشانگر استوار است. این روش‌ها بنا به دلایلی ازجمله طیف‌های جذبی و نشری وسیع و تجزیه ناهمگون مولکول‌های فلوروفور معدنی، دقت تشخیص بالایی ندارند. همچنین نیازمند تجهیزات پرهزینه و پیچیده هستند. امروزه روش‌های رایج تشخیص پروتئین‌ها عمدتاً بر اساس استفاده از ELISA طراحی شده است. در اینجا باوجود مشکلاتی مشابه حالت قبل، علاوه بر نیاز به تجهیزات زیاد برای تکثیر پروتئین‌هایی که در مقادیر کم هستند، یافتن روشی که با روش‌های معمولی مثل ELISA امکان‌پذیر نیست، ضروری است[6[
سنجش به‌وسیله بیوبارکد، روشی با دقت بسیار بالا در شناسایی پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلوئیک می‌باشد. مولکول DNA زیست بارکددار شده حاوی الیگونوکلئوتیدهایی است که جهت ایجاد و تقویت سیگنال‌ها به‌وسیله نانو ذرات باردار شده طلا نشان‌دار گردیده (AuMNPs) تا به این وسیله بتوان پروتئین و DNA هدف را از کل محتوای استخراج‌شده از نمونه‌های گیاهی و بافت مشکوک به بیماری تشخیص داد.
الف) تشخیص DNA
در این روش ابتدا یک زنجیره DNA دو رشته‌ای با توالی دلخواه (Bar-Code DNA) طراحی و پس از فعال شدن، بر روی نانو ذرات طلا نشانده می‌شود. همچنین رشته دیگری که مکمل بخشی از DNA هدف (آنچه قرار است در نمونه شناسایی شود) است، پس از فعال شدن بر روی نانوذره طلا تثبیت می‌شود. سپس اجازه هیبرید شدن رشته بارکد با DNA مکمل داده می‌شود. از طرفی رشته سوم DNA که مکمل بخش دیگری از DNA هدف است، پس از فعال شدن بر روی ذرات مغناطیسی تثبیت می‌شود. با قرار گرفتن این دو ذره در محلول، اگر DNA هدف وجود داشته باشد، حتی در مقادیر بسیار اندک، موجب اتصال این دو ذره به یکدیگر می‌شود. در مرحله بعد با توجه به خاصیت مغناطیسی ذره دوم، می‌توان آن‌ها را از محلول جدا کرد و بعد با استفاده از عواملی (مثل ترکیبات دناتوره‌کننده ) (ترکیباتی که ساختار اصلی و فعال مولکول‌های زیستی مانند DNA و پروتئین‌ها را تغییر می‌دهند.) که دو رشته DNA را جدا می‌کنند، DNA بارکد را از مکمل آن جدا و شناسایی کرد. حتی می‌توان از ترکیباتی مثل نقره که حساسیت تشخیص را بالا می‌برند نیز استفاده کرد. به‌این‌ترتیب مقادیر بسیار اندک از یک توالی DNA بدون نیاز به PCR قابل‌شناسایی و حتی اندازه‌گیری است [6]
ب) تشخیص یا اندازه‌گیری پروتئین با استفاده از Bar-Code DNA
در این روش نیز همانند روش قبل، از یک توالی انتخابی و مکمل آن‌که بر روی نانو ذرات طلا نشانده شده، استفاده می‌شود. همچنین آنتی‌بادی پلی کلونال (Polyclonal antibody) علیه پروتئین مورداندازه‌گیری بر روی این ذرات طلا تثبیت می‌شود. این آنتی‌بادی‌ها بر روی ذرات مغناطیسی نیز نشانده می‌شود. حال با واردکردن این دو ذره در محلول حاوی پروتئین موردنظر، پروتئین به آنتی‌بادی موجود در سطح هر دو ذره متصل شده و آن‌ها را به یکدیگر متصل می‌کند. پس از شستشو و حذف سایر مواد، با توجه به خاصیت مغناطیسی ذره دوم، می‌توان آن را از محلول جدا و همانند روش قبلی، پس از جدا کردن رشته DNA بارکد از مکمل آن با استفاده از مواد دناتوره‌کننده DNA بارکد را، که نمادی از حضور پروتئین موردنظر در نمونه است شناسایی و اندازه‌گیری کرد. به‌این‌ترتیب مقادیر بسیار اندک پروتئین در نمونه قابل‌شناسایی است [6[

3- نتیجه

تجهیزات تشخیصی قابل‌حمل بر پایه نانو ذرات، حسگرهای DNA زیست بارکددار شده و نقاط کوانتومی کاربردهای بالقوه‌ای در شناسایی انواع پاتوژن‌های گیاهی و قارچ‌های مولد سم دارند. تا به امروز، ابزارهای تشخیصی سیار جهت شناسایی سریع بیماری‌های گیاهی توسعه داده‌شده‌اند که همچنین می‌توانند برای جلوگیری از اپیدمی شدن آن‌ها نیز مورداستفاده قرار گیرند. این کیت‌های تشخیصی مبتنی بر نانو نه‌تنها باعث افزایش سرعت شناسایی پاتوژن می‌شوند، بلکه دقت و صحت تشخیص را نیز به‌طور چشمگیری افزایش می‌دهند. دستگاه micro-PCR که با فراهم‌سازی تنها 40 سیکل از PCR و در کمتر از 6 دقیقه قادر به تشخیص پاتوژن می‌باشد، مثال مناسبی در این زمینه است. در آینده‌ای نزدیک، دستگاه‌های در مقیاس نانو با جزئیاتی نوین سیستم کشاورزی هوشمندی را برای بشر به ارمغان خواهند آورد. از مزیت‌های این سامانه‌ها، تشخیص مشکلات گیاهان در حین رشد، قبل از بروز علائم ظاهری و گسترش است. در دهه پیش رو نانوابزارها می‌توانند با سرعتی هزاران بار بیشتر و بسیار ارزان در اختیار قرار گیرند. آینده ابزارهای تشخیص و مدیریت بیماری‌های گیاهی به سمت کوچکترشدن چیپ‌ها و کاربرد هرچه بیشتر فناوری نانو درحرکت است. 

منابع:

[1] Khiyami, M. A., Almoammar, H., Awad, Y. M., Alghuthaymi, M. A. & Abd-Elsalam, K. A. Plant pathogen nanodiagnostic techniques: forthcoming changes, Biotechnol. Equip. 28, 775–785 (2014).

[2] Abd-Elsalam, K. A. Nanoplatforms for plant pathogenic fungi management. Fungal Genom Biol 2 e107. doi (2012).

[3] Monis, P. T. & Giglio, S. Nucleic acid amplification-based techniques for pathogen detection and identification. Infect. Genet. Evol. 6, 2–12 (2006).

[4] Rai, M. & Ingle, A. Role of nanotechnology in agriculture with special reference to management of insect pests. Appl. Microbiol. Biotechnol. 94, 287–293 (2012).

[5] Fan, C. et al. Beyond superquenching: hyper-efficient energy transfer from conjugated polymers to gold nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 6297–6301 (2003).

[6] سیده زهرا بطحایی، "نانوذرات در تشخیص‌های بالینی مولکول‌های زیستی (DNA) و پروتئین در بیماری‌ها"، پایگاه اینترنتی ستاد ویژه توسعه فناوری نانو http://nano.ir/index.php?ctrl=paper&actn=paper_view&id=2966〈=1